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基因編輯類型

基因編輯類型

根据研究的不同目的,需要制备不同的的动物模型。当为了研究基因的功能时需要过表达或敲除相应基因。如果全身敲除目的基因会导致动物死亡时,或需要在特定的组织敲除基因时,可以制备条件敲除小鼠。为了建立基因突变模型时,制备點突變动物模型。制备基因人源化小鼠时,可以进行人源基因的替换。制备不同的动物模型,需采用相应的策略,才能成功获得目标模型。

全身性敲除

基因敲除是研究基因功能的重要方法。傳統ES打靶敲除方法,周期長,費用高。CRISPR/Cas9在基因敲除方面,具有ES無可比擬的優勢,效率高,時間短,最快24天直接獲得基因敲除小鼠。


技術一般的流程

设计合成gRNA→ 显微注射→ 小鼠出生检测。


技術優勢或適合應用的研究

-效率高,最高可達90%的敲除效率,並且有一定純合敲除比例。

-方便檢測,從PCR條帶的大小,容易區分是否發生敲除。

-時間短,最短24天獲得基因敲除小鼠。

-不受敲除片段大小限制,從幾十bp到Mb長度的DNA,都能有效敲除。


成功案例


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圖1:兩個Grna切割位點之間的~550bp基因序列被敲除,PCR檢測,相對于野生帶773bp,發生敲除的鼠産生~220bp的條帶(箭頭指向的條帶)。


?條件性敲除

當基因敲除會導致小鼠死亡時,需要條件敲除,才能獲得成體小鼠用于研究。條件敲除一般使用Cre-loxp系統,其方法是在基因的關鍵區域的兩側,插入loxp。loxp小鼠制備好後,與Cre小鼠雜交,獲得loxp純合,Cre陽性的小鼠,這種小鼠在Cre的作用下,loxp發生重組,中間的序列被刪除,達到敲除基因的目的。目前已經有數百種Cre工具小鼠,可以根據研究需要,購買或定制Cre工具鼠,在不同的組織器官,達到敲除目的基因。Cre融合ER/ERT2後,可以使用tamoxifen調控Cre入核,實現時間上的調控刪除。


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圖1:通過CRISPR輔助,在關鍵外顯子的兩側通過同源重組,插入兩個loxp,在Cre的作用下,loxp之間的外顯子被刪除,實現基因條件敲除。


技術一般的流程

打靶載體設計→ 載體構建→ 顯微注射(EPS打靶)→ 小鼠鑒定。


技術優勢或適合應用的研究

-用于敲除致死的基因

-非致死基因,用條件敲除也可以在不同的組織,不同的時間敲除基因,獲得更多的實驗數據。


成功案例

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圖2:在關鍵外顯子或非3整數倍的外顯子兩側敲入loxp,在Cre的作用下,該區域被刪除,導致基因敲除。


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圖3:設計Loxp插入位點的特異引物與同源臂外側的引物,通過PCR,可以檢測到兩個loxp被正確敲入到目的位置,證明獲得條件敲除小鼠。



隨機轉基因

隨機轉基因是一种经典的过表达基因小鼠制备策略,不同于靶向基因编辑,没有受到新兴基因編輯技術的影响。该方法通过将基因随机整合到基因组中,实现目的基因过表达。


技術一般的流程

過表達載體構建→ 顯微注射→ 小鼠鑒定篩選→ 表達檢測→ 品系建立。


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圖1:轉基因載體和小鼠制備流程。


技術優勢或適合應用的研究

-可以廣譜,或組織特異過表達目的基因。

-多拷貝插入,比定點插入表達量更高。

-受整合位置影響,可能表達沈默,或者表達譜錯誤。


成功案例

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圖2:通過轉基因載體特異的引物設計,檢測到轉基因陽性的小鼠,一般效率在10-20%。


定點轉基因

定點轉基因是将转基因表达载体敲入到Rosa26位点,该位点被证明是在所有组织細胞都活跃的区域,不会发生隨機轉基因中出现的转基因沉默的现象。常用来制作过表达或条件过表达小鼠。条件过表达是在目的基因前面插入loxp包围的Stop序列,阻止目的基因表达。该小鼠模型与Cre小鼠杂交,能够在Cre表达的组织中,删除Stop序列,从而使目的基因发生表达;过表达小鼠直接获得组成性基因表达小鼠。金鹰国际娱乐APP的Rosa26位点的定點轉基因系统,已经实现长达10kb的定點轉基因。


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图1:Rosa26位置敲入转基因表达载体,制备定點轉基因小鼠.



基因敲入

基因敲入是指在基因組的特定位置插入一段DNA序列,例如給基因加GFP熒光標簽標記蛋白,原位敲入制備Cre工具鼠等應用。1kb以下的小片段插入,CRISPR/Cas9效率較高。對于大片段的基因插入,需要使用ES,或者EPS制備策略才能保證項目周期和效率。


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圖1:把綠色熒光蛋白敲入目的基因的C端,融合表達,示蹤目的基因。


技術一般的流程+图解

打靶载体设计→ 载体构建→ 显微注射(EPS打靶)→ 小鼠鉴定。


技術優勢或適合應用的研究

-CRISPR用于小片段的基因敲入。

-ES/EPS用于大片段基因敲入。

-給基因加各種標簽,原位敲入制備Cre工具鼠。


基因替換

基因替換指,根据研究需要,将小鼠的基因替換为其它物种的基因。可以将基因的部分功能区,或者全基因进行替换。1kb以下的小片段替换,可以采用CRISPR/Cas9策略。对于大片段的基因替換,需要使用ES,或者EPS制备策略才能成功。


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圖1:用其它種系的基因,替換小鼠的基因片段。


技術一般的流程+图解

打靶載體設計→ 載體構建→ 顯微注射(EPS打靶)→ 小鼠鑒定。


技術優勢或適合應用的研究

-CRISPR用于小片段的基因替換。

-ES/EPS用于大片段基因替換。


3)基因人源化小鼠的制備,如PD1等免疫檢查點人源化小鼠的制備。


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图1 EPS小片段敲入效率高达90%


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图2 EPS系统对于长达20kb的大片段敲入,也具有很高的效率。


點突變

许多疾病由氨基酸突变引起,为了构建此类疾病模型,可以将小鼠的对应基因的位点进行突变。单链DNA在點突變方面有较高的成功率。


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图1 单链DNA模板制备點突變小鼠。


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图2 PCR扩增包含突变位点的序列,测序检测发生點突變的小鼠,目标碱基出现套峰,证明获得杂合突变小鼠。


技術一般的流程

gRNA设计→ 供体DNA合成→ 显微注射(EPS打靶)→ 小鼠鉴定。


技術優勢或適合應用的研究

-氨基酸突變類小鼠疾病模型模擬

-CRISPR點突變效率相对较高